噬菌體效價(jià)--------指噬菌體的濃度,即每毫升樣品含噬菌體的個(gè)數(shù).通常是在含敏感菌的平板上形成噬菌斑進(jìn)行噬菌體的計(jì)數(shù),以每毫升中含有的噬菌斑形成單位(plaque forming unit/ml或pfu/ml)表示其效價(jià).
例如,若每塊平皿加1 l稀釋106倍的樣品,可形成10個(gè)噬菌斑,則噬菌體效價(jià)為1010pfu/ml.(106*10*1000=1010;1ml=1000ml)
5、 方法
51 噬菌體的檢查
51.1 樣品采集
將2～3g土樣或5mL水樣（如陰溝污水）放入滅菌三角瓶中，加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的敏感指示菌（大腸桿菌(Escherichia coli)）菌液3～5mL，再加20mL二倍肉湯蛋白胨培養(yǎng)液。
51.2 增殖培養(yǎng)
30℃振蕩培養(yǎng)12～18h, 使噬菌體增殖。
51.3 離心分離
將上述培養(yǎng)液以3000rpm離心15～20min, 取上清液，用pH7.0，1%蛋白胨水稀釋至10-2～10-3，用于噬菌體檢查及效價(jià)測(cè)定。
51.4 生物測(cè)定法
51.4.1雙層瓊脂平板法
51.4.1.1 倒下層瓊脂
融化下層培養(yǎng)基，倒平板（約10mL/皿）待用。
51.4.1.2倒上層瓊脂
融化上層培養(yǎng)基，待融化的上層培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)，每管中加入敏感指示菌 (大腸桿菌(Escherichia coli)) 菌液0.2mL，待檢樣品液或上述噬菌體增殖液0.2～0.5mL，混合后立即倒入上層平板鋪平。
51.4.1.3恒溫培養(yǎng)
30℃恒溫培養(yǎng)6～12h觀察結(jié)果。
51.4.1.4 觀察結(jié)果
如有噬菌體，則在雙層培養(yǎng)基的上層出現(xiàn)透亮無(wú)菌圓形空斑──噬菌斑。
51.4.2 單層瓊脂平板法
省略下層培養(yǎng)基，將上層培養(yǎng)基的瓊脂量增加至2%，融化后冷卻至45℃左右，如同上法加入指示菌和檢樣，混合后迅速倒平板。30℃恒溫培養(yǎng)6～16h后觀察結(jié)果。
51.5 離心分離加熱法（快速檢查）
取大腸桿菌(Escherichia coli)正常培養(yǎng)液和侵染有噬菌體的異常大腸桿菌(Escherichia coli)培養(yǎng)液，4000rpm離心20min，分別取兩組發(fā)酵液的上清液(A1)，一部分于721分光光度計(jì)上測(cè)定OD650光密度值，另外各取5mL上清液于試管中，置水浴中煮沸2min（A2），檢測(cè)A2溶液OD650光密度值，記錄結(jié)果。
52 噬菌體效價(jià)的測(cè)定
52.1 倒平板
將融化后冷卻到45℃左右的下層肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基傾倒于11個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每皿約傾注10mL培養(yǎng)基，平放，待冷凝后在培養(yǎng)皿底部注明噬菌體稀釋度。
52.2 稀釋噬菌體
按10倍稀釋法，吸取0.5mL大腸桿菌(Escherichia coli)噬菌體，注入一支裝有4.5mL1%蛋白胨水的試管中，即稀釋到10-1，依次稀釋到10-6稀釋度。
53 噬菌體與菌液混合
將11支滅菌空試管分別標(biāo)記10-4、10-5、10-6和對(duì)照。分別從10-4、10-5和10-6噬菌體稀釋液中吸取0.1mL于上述編號(hào)的無(wú)菌試管中，每個(gè)稀釋度平行做三個(gè)管，在另外兩支對(duì)照管中加0.1mL無(wú)菌水，并分別于各管中加入0.2mL大腸桿菌(Escherichia coli)菌懸液，振蕩試管使菌液與噬菌體液混合均勻，置37℃水浴中保溫5min，讓噬菌體粒子充分吸附并侵入菌體細(xì)胞。
54.4 接種上層平板
將11支融化并保溫于45℃的上層肉膏蛋白胨半固體瓊脂培養(yǎng)基5mL分別加入到含有噬菌體和敏感菌液的混合管中，迅速搓勻，立即倒入相應(yīng)編號(hào)的底層培養(yǎng)基平板表面，邊倒入邊搖動(dòng)平板使其迅速地鋪展表面。水平靜置，凝固后置37℃培養(yǎng)。
55 觀察并計(jì)數(shù)
觀察平板中的噬菌斑，并將結(jié)果記錄于實(shí)驗(yàn)報(bào)告表格內(nèi)，選取每皿有30～300個(gè)噬菌斑的平板計(jì)算噬菌體效價(jià)。
計(jì)算公式： N=Y/V X
（N：效價(jià)值，Y：平均噬菌斑數(shù)／皿，V：取樣量，X：稀釋度）
例如：當(dāng)稀釋度為10-6時(shí)，取樣量為0.1 mL/皿，同一稀釋度中3個(gè)平板上的噬菌斑的平均值為186個(gè)，則該樣品的效價(jià)為：N＝186／0.1×10-6＝1.86×109。
6、 結(jié)果
61 噬菌體檢查
61.1離心分離加熱法
處理方法 OD650光密度值
正常發(fā)酵液（對(duì)照） 異常發(fā)酵液（試驗(yàn)）
離心上清液(A1)
離心上清液加熱煮沸后(A2)
A2/A1
61.2 繪出平板上的噬菌斑檢測(cè)結(jié)果，指出噬菌斑和宿主細(xì)菌。
62 噬菌體效價(jià)測(cè)定
62.1 平板上噬菌斑數(shù)目
噬菌體稀釋度 10-4 10-5 10-6 對(duì)照
噬菌斑數(shù)（個(gè)）/皿
平均每皿噬菌斑數(shù)目
62.2 計(jì)算噬菌體效價(jià)(即噬菌斑形成單位pfu, plague-forming unit).
7、 思考
1、有哪些方法可檢查發(fā)酵液中確有噬菌體存在？比較其優(yōu)缺點(diǎn)。
2、測(cè)定噬菌體效價(jià)的原理是什么？要提高測(cè)定的準(zhǔn)確性應(yīng)注意哪些操作？
3、噬菌體與菌液混合后保溫時(shí)間越長(zhǎng)其吸附率越高的說(shuō)法對(duì)嗎？
回復(fù)
吸收率：在噬菌體和過(guò)量菌液混合后，菌/噬菌體混合液中未感染的噬菌體顆粒經(jīng)過(guò)氯仿處理后，在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)其數(shù)量。一般情況下幾分鐘內(nèi)噬菌體即可大部分吸附到宿主菌上.
潛伏期：細(xì)菌與噬菌體混合作用5分鐘后，徹底清洗以除去未結(jié)合的噬菌體。然后用新鮮的培養(yǎng)基重懸至相同體積。該重懸液在370C下孵育，其間有規(guī)則地收集噬菌體測(cè)滴度。
裂解量指的是單個(gè)宿主細(xì)菌被噬菌體完全裂解后所釋放的噬菌體數(shù)量.具體檢測(cè)方法本人也不是很清楚.
